У чому полягає лабораторний тест на коронавірус

У чому полягає лабораторний тест на коронавірус

Пінчук Георгій
Автор
Пінчук Георгій
UA.NEWS
Поделиться:

Друзі, мене питають, у чому саме полягає лабораторний тест на коронавірус. Спробую відповісти якомога простіше, без зайвої термінології. Тест називається «полімеразна ланцюгова реакція» (ПЛР, російською ПЦР, англійською PCR). Він полягає в тому, що генетичний код віруса можна розмножити в пробірці за досить короткий час приблизно у мільон разів, і завдяки такому розмноженню буквально побачити його як смужку в агарозному гелі, або як пік на екрані прилада-флюоріметра.

Техніку «розмноження» придумав американський вчений-хімік фінського походження на ім»я Карі Мулліс ще на початку 1980-х років. Для розмноження потрібна суміш окремих нуклеотидів (нуклеотид — це як цеглинка, з яких будується нуклеїнова кислота, що є носієм генетичного коду віруса). Цю суміш розчиняють y воді і пакують в маленькі пробірки. Далі, потрібні два ферменти. Один з них називається зворотня транскриптаза (скорочено RT, від англійського reverse transcriptase). Другий фермент зветься Taq-полімераза (від назви термостійкої бактерії, з якії цей фермент екстрагують — Thermus aquaticus). Кожний з цих ферментів також фасується в маленькі пробірочки. Всі ці пробірочки зберігають при низькій температурі, -16 -18 Цельсія, в морозилці. Для тесту спочатку беруть матеріал від хворого і екстрагують з нього РНК (для цього є спеціальні протоколи, а головним екстрактором є просто 70-градусний спирт). Потім екстраговану РНК змішують з розчином нуклеотидів ДНК, додають RT i ставлять у тепло (воду з температурою 37 градусів С). Відбувається реакція зворотньої транскрипції, тобто однониткова вірусна РНК перетворюється на ДНК.

Далі, таку ДНК поміщають у розчин, куди додають (знову) суміш нуклетидів, і так звані «праймери.» Праймер — це коротенький ланцюжок нуклеотидів, який «парується» з ниткою ДНК згідно з законом Чаргаффа (американський біохімік родом з Чернівців, Україна). За цим законом, є «взаємно доповнюючі» нуклеотиди — до нуклеотиду А доповнюючим є нуклеотид Т, а до нуклеотида G — нуклеотид С. Таким чином, якщо ДНК починається з послідовності AACGCAGGCACGT, праймером буде TTGCGTCCGTGCA і т.д. Праймери до відомих послідовностей ДНК продаються багатьма фірмами, і їх також не особливо важко зробити самим на досить нехитрій машинці.

Наступний етап — додавання Taq-полімерази і встановлення пробірок в луночки апарату, який запрограмований на кілька раундів нагрівання і охолодження. В момент включення цього апарату всі інгредієнти знаходяться в розчині. Але вже перший підйом температури до 45-50 градусів змушує праймери прикріпитися до своїх «парних» нуклеотидів — а це служить, як кажуть, «затравкою» для реакції. Потім температура піднімається до 95-98 градусів, при цьому ДНК знову розпадається («тане») на окремі нуклеотиди, але спрацьовує Taq-полімераза, яка підхоплює окремі розчинені нуклеотиди і «парує»їх за законом Чаргаффа. Потім суміш знову охолоджують, і зновy нагрівають; Taq-полімераза від цього не руйнується (термостійка!), і продовжує подвоювати нитку oригінальної ДНК. Коли подвоєння закінчується. подальші раунди нагрівання і охолодження приводять до збільшення кількості ниток у 4,8,16, 32, 64 рази тощо. Розмноження до мільйону ниток можна досягти за якісь дві- дві з половиною години.

Остаточний продукт ПЛР можна розігнати в гелі (це щось типу плаского кавалка желатину), до якого підключена електрика: ДНК завжди біжить від негативного полюсу геля до позитивного, і зупиняється тим далі від позитивного полюсу, чим вона важча. Точну позицію (а значить і розмір) ДНК можна встановити за допомогою флуоресцентних забарвників, наприклад етидію броміда. В ідеалі, якщо тест стовідсотково специфічний, він покаже смужку ДНК з розміром, який відповідає вже відомому розміру РНК віруса SARS-CoV-2 в матеріалі від інфікованої людини, і НІЯКОЇ смужки ДНК (окрім зовсім коротюсіньких праймерів) у не-інфікованої цим вірусом людини. (На жаль, в реальному житті жоден тест не є стовідсотково специфічним.)

Наскільки я знаю, комплекти для ПРЛ на виявлення SARS-CoV-2 має, і розподіляє по країнах світу, Всесвітня організація охорони здоров’я (ВООЗ). Я нічого не знаю про комерційну складову цього розподілення. В принципі, по-справжньому дорого коштує тільки Taq-полімераза; її за законом має право виробляти тільки одна компанія, Промега (штаб-квартира у США, місто Медісон, штат Вісконсін). На другому місці за ціною, мабуть, праймери, але їх можна зробити і самим, оскільки сіквенс РНК головних коронавірусів вже відомий. Досить дорого коштує і сучасна машина, яка робить цикли охолодження й нагрівання, але вона може обслуговувати кілька десятків зразків від хворих водночас.

Те, що я написав — тільки дуже спрощений нарис процедури. Є багато деталей, про які вам краще за мене роскажуть мої грузі-генетики і молекулярні біологи Dmytro MykytenkoOuliana DzhamanYakiv VitrenkoOksana Piven, i Volodymyr A. Halytskiy. На картинках показано, як виглядає результат ПЛР і як виглядає ПЛР-машина.

Матеріал опубліковано мовою оригіналу. Джерело: Facebook.

загрузка...
Поделиться:

Добавить комментарий

Такой e-mail уже зарегистрирован. Воспользуйтесь формой входа или введите другой.

Вы ввели некорректные логин или пароль

Sorry that something went wrong, repeat again!